绿色荧光蛋白,绿色荧光蛋白发光原理

1、绿色荧光蛋白的发现过程

在1962 年下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。

这种蛋白质最早是由下村修等人在1962年在维多利亚多管发光水母中发现。 这个发光的过程中还需要冷光蛋白质水母素的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子可产生交互作用。

我们知道，荧光的发光是被一定波长光激发后，电子被激发到高能级，随后向低能级跃迁的过程中发出比激发光波长更长的荧光，这也就是上面提到的受激辐射。我们将能接受光辐射，并跃迁发出颜色光的基团叫做生色团。

本人亲身体验证明，真的可以看见，颜色类似于抹茶沙拉酱，破菌后可以看到明显的亮绿色。当然跟表达量也有关系，本人表达量为4mg/L菌液。

是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色萤光。虽然许多其他海洋生物也有类似的绿色荧光蛋白，但传统上，绿色荧光蛋白（GFP）指首先从维多利亚多管发光水母中分离的蛋白质。

2、绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列有多大

1、EGFP是GFP突变系，应用较多的是GFP的突变体：增强型绿色荧光蛋白（EGFP ）（64位苯丙一亮），发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。

2、荧光是荧光蛋白最特别的特点，而其中的发色团起着主要的作用。在 α-螺旋上的 6667位氨基酸—— 丝氨酸 、 酪氨酸 、 甘氨酸 经过环化、脱氢等作用后形成发色团。GFP由238个氨基酸残基组成，分子量约27kDa。

3、转基因的方式目前有定点转基因，也可以叫做基因敲入，这种情况下，肯定会表达的；如果是传统随机插入方式的转基因就不一定了，因为传统转基因的位点是不确定的，所以转入的基因可能会被沉默掉，所以不表达。

4、一个氨基酸对应mRNA上3个碱基，也是三个核苷酸，对应的DNA上就是3个碱基对，3*2个核苷酸，所以是238*3*2，但是基因的长度要比这个数值大，因为基因中还有非编码区、内含子这样的序列。

3、绿色荧光蛋白会淬灭吗

β-圆筒与短α-螺旋形成致密的结构域，使配体不能扩散进入，生色团被严格保 护在筒内，因此其性质稳定，不易被淬灭。

构建载体后绿色荧光蛋白不发荧光的原因，是使用时如果导致绿色荧光电白淬灭。根据查询相关资料信息，导致绿色荧光电白淬灭的原因有因荧光物质的分子和熄灭剂分子碰撞而损失能量。

即为荧光猝灭法。荧光漂白后的恢复技术是使用亲脂性或亲水性的荧光分子，如荧光素、绿色荧光蛋白等与蛋白或脂质耦联，用于检测所标记分子在活体细胞表面或细胞内部运动及其迁移速率。

甲醛固定细胞会不会灭活绿色荧光蛋白 绿色荧光蛋的发光机理比荧光素/荧光素酶要简单得多。一种荧光素酶只能与相对应的一种荧光素合作来发光，而绿色荧光蛋白并不需要与其他物质合作，只需要用蓝光照射，就能自己发光。

利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。

4、绿色荧光蛋白基因是怎样产生的?

1、GFP是指产生绿色荧光蛋白的基因。利用 DNA 重组技术，科学家们将Gfp基因与另一个产生他们想要研究的蛋白质的基因结合 ，然后将复合物插入细胞中。如果细胞产生绿色荧光，科学家推断该细胞也表达目标基因。

2、荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。由于荧光素酶检测简便、灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程方面已成为广泛使用的报告基因，具有检测灵敏度高，没有信号背景，并且不损害植物的优点。

3、绿色荧光蛋白最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。

4、绿色荧光蛋白含有一个三肽的单位Ser（65）-Tyr（66）-Gly（67），在蛋白质折叠的时候，这三个氨基酸会折叠成5元环的咪唑酮的结构，也就是生色团。

5、还可以通过哪些方法验证绿色荧光蛋白的表达

1、利用荧光值（FSU）与样品浓度做出标准曲线 校准 1 使用Modulus检测未知样品前，你可以使用rAcGFP1稀释液来校准Modulus仪器 2 使用表1中的5个稀释液来校准Modulus。

2、如果只想看到荧光，可以直接放在紫外灯下，就会显荧光。 如果是观察亚细胞定位，就用激光共聚焦显微镜，不需要那么麻烦的制片过程，直接观察，逐层扫描。

3、如果是想在植物细胞或动物细胞里表达，利用菌落PCR筛选出真阳性菌株，再扩培阳性菌株，抽提质粒。植物的话，一般是再转到农杆菌里，利用农杆菌转染植株，使得GFP插入植株染色体，表达GFP蛋白。

4、最直接的就是检测目的蛋白，一般都是用western blot；如果是分泌蛋白，可以做ELISA；如果蛋白有特殊的功能（比如GFP，绿色荧光蛋白），也可以直接检测其功能（比如看有无绿色荧光）。